随心而为

随心而为
haihao8.blog.tianya.cn   [复制]  [收藏]
随便写写,胡乱聊聊

博客信息
博主:haihao8 
栏目分类
博客登录
用户:
密码:
留言
友情博客
标签列表
博客搜索
日志存档
友情链接
统计信息
  • 访问:19974 次
  • 今日访问:1次
  • 日志: -236篇
  • 评论: 3 个
  • 留言: 0 个
  • 建站时间: 2008-10-26
博客成员
最近访客



群星璀璨:CRISPR 技术的研发之路(四)
<< 下一篇>>
作者:haihao8 提交日期:2017-2-28 3:19:00 | 分类:未分类 | 访问量:16602

科学成就是能够站在巨人肩上再进一步

   Virginijus Siksnys生于苏联时代的立陶宛,1982年博士毕业于莫斯科国立大学,专业是酶动力学,然后在家乡的应用酶学研究所工作了十一年,1993作为访问学者去了德国的Max Planck 研究所,95年在立陶宛维尔纽斯大学担任高级研究职位至今(首席科学家、教授、立陶宛科学院院士、生物技术评委会主席)。

   Siksnys 的专业方向是寻找并定义限制性内切酶的特性,做了二十几年,几乎到了麻木的程度。2007年一系列关于CRISPR的论文(Hrvath,Barrangou,Moineau)的发表,重新燃起了他对微生物的兴趣,他坚信自己可以做到的是:在体外(in vitro)重现CRISPR系统的作用。他和同事们完成了如下几个重要实验:

   1, 测试来自不同物种的CRISPR系统是否能够继续行驶正常功能。他们把嗜热链球菌的CRISPR系统,输入到大肠杆菌细胞内。实验证明:大肠杆菌也因此产生了对特定质粒和噬菌体的抵抗力。同时证明了cas9蛋白是CRISPR系统唯一必需的核酸酶,其含有两个重要的核酸酶功能集团: RuvC- 和HNH- (Bolotin 和 Makarova 分别在2005 和2006年的论文里论证了这个观点)。以上实验作为论文于2011年8月3号发表在《核酸研究》。

   意义:不同物种间可以共用相同的CRISPR!

   2, 提纯嗜热链球菌的Cas9-crRNA复合物。一,实验证明Cas9-crRNA复合物在靶标DNA的PAM结构前三个核苷酸处切出钝型切口 -----体外(in vitro)重现了Moineau的in vivo实验。二,实验证明可以人工改变CRISPR结构中的spacer序列,从而任意选定DNA序列进行精准切割。三,通过突变实验证明:cas9蛋白的两个功能集团的具体作用:HNH-负责切割与crRNA互补的DNA链,而RuvC- 则负责切割另条DNA链。四,实验证明:crRNA可以被缩短到只有20个核苷酸而仍然保持功能有效性。这篇论文发表于2012年9月25号的《美国国家科学院报》。

   意义:人为指定需要被切割的DNA序列!

   3, 把提纯的Cas9蛋白、人工合成的crRNA、人工合成的tracrRNA、以及提纯的核酸酶III进行体外(in vitro)组合,再现了其对特定靶标DNA的切割功能,并证明两个RNAs缺一不可。这最后一项研究,Siksnys没有写进论文,而是和前面的实验结论结合,于2012年3月20号发给了美国专利局:US2015/0045546

   意义:CRISPR系统的完备组合零件!

   “无心插柳”的Charpentier虽然以发现tracrRNA而青史留名,但这句俗语还有后半句,即“柳成行”。所以,显见得中国古人早有预测:她应该不会止步于仅仅做出一个贡献。2011年3月,她在波多黎各举行的美国微生物年会上做关于tracrRNA的演讲时,结识了当时正冉冉升起的结构生物学的世界级新星:Jennifer Doudna。看到这个名字的第一个念头就是,以后起名字一定要历史和现代相结合,才能成就事业高峰。Doudna的意思很简单:静物画大师窦(Gerrit Dou)加上DNA。

   Doudna,博士毕业于哈佛大学,博士后在卡罗拉多大学,1994年和2002年先后在耶鲁大学和加州伯克利大学有了自己的实验室。她的研究对象是RNA,其中之一是利用结晶学和低温电子显微镜,呈现了大肠杆菌的CRISPR系统中cas蛋白的复杂结构(大肠杆菌的cas蛋白是一个系列,叫做Cascade,比古菌和链球菌的cas蛋白要复杂得多)。Doudna获得的生物医学界荣誉和奖项无数,自1997年以来一直是HHMI学者头衔。

   Doudna和Charpentier两人相见恨晚,一拍即合,立即合作进行了类似于Siksnys的CRISPR系统in vitro研究。同样用实验证明了:Cas9可以体外切割DNA;crRNA的序列可以人为设定,从而定向切割靶标DNA;crRNA和tracrRNA缺一不可,都是CRISPR系统的必需要件。

   另外,她们还证明了:crRNA和tracrRNA可in vitro互补为一个sgRNA(single-guide RNA)而行使其功能。这个发现后来被广泛应用于基因组裁剪技术。

   这篇论文发表于2012年6月28号的《科学》期刊,比Siksnys同年9月发表在《美国国家科学院报》的论文要早三个月。

   不过值得一提的是,Siksnys是2012年4月把论文先投给了《细胞》期刊,6天后就被退稿!只好重新修改浓缩,5月转投《美国国家科学院报》,9月发表。这也没话好说,只能是“庸编误人”。

   Doudna和Charpentier于2012年5月25号向美国专利局发出了专利申请。

   CRISPR是细菌和古菌中的获得性免疫系统,具有定向切割已被“记忆”的入侵DNA的功能,经过实验证明:这个“记忆”可以人为改变,从而导致CRISPR系统去切割任何被人为储存于“记忆”中的DNA序列的特定位点。这说的是 in vivo,细菌和古菌体内发生的事情。

   如今,Siksnys, Doudna和Charpentier分别在体外(in vitro)试管内组合了这个系统,实验证明了它完全可以发挥其应有的功能。也就是说,工具有了,用在何处,是细菌、古菌、还是真核生物;是真菌、植物、还是动物;是线虫、果蝇、蚊子、斑马鱼、老鼠、猪、还是人,这些就都随使用工具之人的意愿了。

   2012年6月,Doudna和Charpentier在《科学》上发表的那篇“体外工具完成”的论文,被引用了二千三百多次,也因此而引发了群雄(也包括雌)大战,全世界数不清的科学家受其鼓舞而纷纷投身其中,轰轰烈烈的CRISPR技术应用运动从此展开。从那儿开始,若是没听说过CRISPR,你都不好意思承认自己正在分子生物学领域混饭吃。

   Doudna并没有止步于此,她随即把CRISPR系统用在了HEK293T细胞系上。HEK293T (Human Embryonic Kidney 293T)是最常见的人类细胞系,来源于人类胚胎肾细胞,不仅做研究用,还是人工制造许多人类或哺乳动物蛋白质的“工厂”。实验证明:CRISPR可以定点改变人类细胞的基因!

   实验发现,CRISPR系统用于人类细胞,还有几点需要改进:

   1, sgRNA需要延长一些,在其3’端形成一个发卡结构(回文序列所造成),才能使CRISPR的功能更有效率;

   2, CRISPR系统需要穿过人类的细胞核膜去改变基因组序列(细菌和古菌没有细胞核),因此需要在其尾端加入NLS(nuclear localization signal),才能保证其穿过核膜进入细胞核内。

   这篇论文于2013年1月29号发表在《eLIFE》。eLIFE在2012年底由美英德三大家医学生物学研究的顶级研究所共同创办:美国的HHMI,英国的Wellcome Trust,和德国的Max Planck, 声望和威力不同凡响。

   随后,Doudna 又在2014年12月15号在《eLIFE》上发表论文,实验证明了向人类细胞输入CRISPR系统和细胞的生长周期的重要关系。

   张峰(Feng Zhang),1982年生于中国石家庄,11岁移民美国爱荷华州得梅茵市(Des Moines)。据说是看了电影《Jurassic Park》被震撼而倾心于分子生物学。十一年级参加MIT举办的科研夏令营,2000年高中毕业,同年获得英特尔科学天才三等奖。哈佛本科,斯坦福博士,哈佛博士后,MIT任职,2011年进入博德研究所(Broad Institute of MIT and Harvard),副教授。他的主要研究方向自始至终很专注:基因组剪裁。

   2011年2月的一天,张锋从哈佛微生物学家Michael Gilmore的演讲中听说了CRISPR。他第二天在迈阿密有个科学研讨会,虽然人飞了去,心却留在了CRISPR----竟然躲在酒店房间里没日没夜地搜索阅读所有关于CRISPR的论文。

   张锋回到波士顿后展开了对CRISPR系统应用于人类细胞的实验,他的研究对象是也是HEK293,有小幅改变,但基本和Doudna的实验一致;随后他又实验证明可以同时切割DNA的不同位点,只要把CRISPR的spacers序列进行各种所需的改变。

   这篇论文于2013年1月3号发表在《科学》期刊在线版,比Doudna那篇应用于人类细胞基因组的论文早了26天!而这篇张锋的论文,属于实际应用于哺乳动物细胞,因此其引用次数接近三千。

   张锋于2012年12月12号向美国专利局递交了CRISPR的专利申请。

   CRISPR剪裁基因组的技术到此算是比较成熟,至今还在不断更新,但都属于小打小闹了。众星照耀,人类又向前迈了一大步。

 

写于二零一六年八月



#日志日期:2017-2-28 星期二(Tuesday) 晴 复制链接 举报



登录 | 新人注册>>
输入您的评论:(不支持HTML标签)


验证码
本文所属博客:随心而为
引用地址:


© 天涯社区