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群星璀璨: CRISPR 技术的研发之路 (三)
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作者:haihao8 提交日期:2017-2-25 0:01:00 | 分类:未分类 | 访问量:320

进一步证实CRISPR功能并合理推论其广远前景

   Luciano Marraffini 是在芝加哥大学做关于葡萄球菌的博士论文接近结尾时,从Malcolm Casadaban那儿听说了CRISPR。Casadaban是噬菌体遗传学界的世界级权威,他自2005年CRISPR闻世以来,就敏锐地意识到了它的获得性免疫的重要性,因此而见人就说CRISPR。Marraffini被他说服,对CRISPR产生了极大的兴趣。

   Marraffini认为,CRISPR不可能如RNA干扰系统那样切割mRNA,因为RNAi系统的效率性太低了,根本无法应付噬菌体在细菌体内指数级的爆发性复制的生长速度。CRISPR只能依靠追根溯源,直接切割噬菌体侵入时的DNA,才有可能达到控制其复制的目的。

   由于妻子的工作原因,Marraffini希望能在芝加哥地区找到博士后的offer,结果他说服了西北大学的Erik Sontheimer,一位研究RNA剪接和RNA干扰的生化专家,去他的实验室做博士后,研究CRISPR。

   Marraffini一完成博士论文,在去西北大学之前,就迫不及待地开始了对CRISPR的研究,他想知道葡萄球菌的CRISPR系统是否能抵御质粒的进入。通过实验显示:一种含有金黄色葡萄球菌 nes基因的质粒,无法进入CRISPR序列里含有吻合于此nes基因片段的spacer的表皮葡萄球菌。而只要把这两者之间的任一序列加以改变,造成二者序列不再吻合,这种抵抗力就消失了。非常简明扼要的实验,证明了CRISPR是如何抵御质粒、病毒(噬菌体)的侵犯。

   到西北大学之后,Marraffini和Sontheimer期望能用实验确定CRISPR的切割对象是DNA。这个实验如果使用传统办法来做,应该是分离cas蛋白,然后在体外(in vitro)的方式切割RNA 和 DNA,来决定其切割对象。但他们当时手中的研究材料是表皮葡萄球菌,其由于不是细菌的研究模型而还没有被研究得很深入。而且表皮葡萄球菌有九种不同的cas蛋白,实验进行起来将会比较复杂。于是,他们把实验重心转移到分子水平,十分巧妙地进行了设计。

   他们在质粒中和spacer吻合的那段nes基因的序列里,加入了一段intron序列。

   Intron和exon是生物中常见的基因序列形式。在一个基因的DNA序列里,通常是intron和exon呈片段状地交叉存在,intron的序列不表达基因密码,当一起被转录成RNA后,通过细胞内酶的作用而把intron(s)切除,这个过程叫做RNA splicing (RNA剪接----注意,Sontheimer是研究RNA剪接的专家),把原本被introns分开的所有的exons链接在一起,成为mRNA,其携带了这个基因完整的全部密码。一般来说,细菌基因中没有intron。

   在nes基因中加入intron这个设计的目的是区别CRISPR的切割对象。如果CRISPR切割的是DNA,那么把这个新设计的质粒转入表皮葡萄球菌后,CRISPR不能切割它----因为那段原本和spacer吻合的质粒中的nes基因序列因为插入了一段intron而不吻合了,从而导致细菌被感染。但如果CRISPR切割的是mRNA,由于RNA splicing的作用,转入细菌的质粒转录的RNA 序列中的intron被去除,mRNA恢复了与spacer吻合的序列,CRISPR就可以对其进行切割,导致质粒基因无法表达,不能被成功转入----细菌不被感染。

   结果明了且毋庸置疑:CRISPR切割的对象是DNA!

   这个证明有多震撼?人类找到一种可以准确切割生物细胞基因组DNA的新工具!

   Marraffini和Sontheimer敏锐地意识到了之一点,他们在论文中写道:“从实际应用的角度来看,具备定向切断任何已知24到48个核苷酸序列的DNA的能力的(CRISPR),前途不可限量,尤其是如果这个系统可以被应用到超出其原生的细菌域和古菌域外(的其他生物----真核域)。“From a practical standpoint, the ability to direct the specific addressable destruction of DNA that contains any given 24- to 48- nucleotide target sequence could have considerable functional utility, especially if the system can function outside of its native bacterial or archaeal context.”

   他俩特意申请了CRISPR的应用专利,包括了裁剪和修正真核生物的基因组序列。只是由于缺少足够的真核生物的实验数据支持,他俩最后不得不放弃了这项专利。这篇设计既精巧又简便且具有“先知”水准的论文,在2008年9月23日直接发给了美国专利局,后来又主动予以放弃:US2010/0076057。

   Sylvain Moineau与在Phodia食品公司工作的Philippe Horvath合作而证明了CRISPR是细菌的获得性免疫系统后,继续与收购了Phodia的Danish公司合作,期望更深入的研究CRISPR剪裁DNA的机制。

   困难来自于CRISPR系统cas9蛋白的效率很高,噬菌体入侵细菌后,其DNA很快就被分解,很难观测到剪裁的具体过程。好在他们很幸运,在研究Streptococcus thermophiles抵抗质粒时,他们发现了几株减弱了抵抗力的菌株。在其中一株这种低效免疫的细菌体内,甚至观察到了刚刚被切割而呈线型的质粒。

   质粒和噬菌体相似,其DNA为环形,一般呈双链螺旋结构,由于扭转的原因,这个结构在外形上呈现“高度螺旋”状,好比两条彼此缠绕拧转的橡皮筋扭结成一团乱麻的形状。这是其正常的外观,叫做super-coiled。一旦在一条链上出现一个切口,那么整个“螺旋”解套,就会呈现一个松弛的环形(由于双链彼此互补,二级结构导致其被切开的单链并不“松开”呈线型,而是继续与另一环形单链结合在一起);如果两条链在相近的位置被切开,就变成了线型结构。

   Sylvain Moineau及其合作者们分离了这些在细菌体内呈线型状态的质粒,经过测序发现:质粒的断开处为钝型切口(DNA内切酶的切口有两种形式:一是钝型,既在对等的核苷酸碱基处切开,形成“平头”;另一种是overhang(or sticky end),切点处两链错开几个核苷酸),切断点位于PAM(proto-spacer adjacent motif---NGG)结构前端三个核苷酸处。把对质粒的研究扩展到病毒,他们发现所有的切点都在PAM之前三个核苷酸处。而且,他们还发现:细菌的CRISPR的序列中,spacers序列和噬菌体(病毒)基因序列吻合的数目,等于噬菌体基因被切开的位点数。

   这个研究很好地证明了cas9内切酶是依据crRNA(spacer)的序列而有目的地切断靶标DNA的精确位点。这篇论文发表在2010年11月4号的《自然》期刊。

   到此为止,除了开山祖师茂季卡是因为研究盐的浓度对DNA序列变化的影响,而意外发现了CRISPR外,其他研究者们都是“有心栽花”,沿着茂季卡给出的方向,目标明确地对准了CRISPR进行深掘。但科学研究有时还会带来惊喜,只要保有足够的好奇心和认真对待所有研究结果,“无心插柳”也常常会有意外的收获。

   Emmanuelle Charpentier 于1995年从巴斯德研究所获得博士学位,在纽约做了6年的博士后研究,然后于2002年在维也纳大学和2008年在瑞典的于默澳大学有了自己的实验室。她的兴趣是寻找微生物中行使调控作用的RNA,通过生物信息程序搜索化脓性链球菌(S. pyogenes)基因组中的非基因序列(所谓的“垃圾DNA”)。她因此而发现了几个感兴趣的区域,其中之一靠近CRISPR。但由于无法获得这些RNAs的实验数据,她遭遇了研究瓶颈。

   2007年,国际RNA研讨会在美国威斯康星州的麦迪逊市举行。会上,Charpentier认识了J?rg Vogel。Vogel在瑞典乌普萨拉大学及耶路撒冷大学做博士后时,就开始了对致病菌的RNA的研究,2004年他在柏林的Max Planck研究所拥有了自己的实验室。随着当时基因测序技术的大幅度跃进,Vogel意识到大量的平行测序将导致任何一种致病菌的所有转录产物都被列出。因此,他刚刚申请了对胃溃疡的致病菌幽门螺旋杆菌的测序。和Charpentier探讨后,两人决定把化脓性链球菌也加进来。

   测序导致了一项重大发现:DNA的转录产物除去最多的核糖体RNA和转移RNA外,第三多的竟然是Charpentier发现的那个贴着CRISPR的小RNA,它由25个核苷酸组成,其序列近乎完美地与CRISPR中重复结构互补。

   随后他们用基因切断的实验证明:这段小RNA被转录后,与crRNA的前体互补结合,随后被RNA酶III(RNAaeIII)切割修饰为成熟的crRNA。这段小RNA对于crRNA的形成以及CRISPR的功能必不可少,被命名为tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA),论文发表在2011年3月31号的《自然》期刊。

   Charpentier 和 Vogel 初始的研究目标是调控RNA,对于其调控对象并没有明确的方向。只是研究结果导致他们聚焦到了tracrRNA,从而对CRISPR系统理论机制的完善,做出了重大贡献。

   后来研究者们用实验还证明:tracrRNA也是cas9核酸酶切割DNA的必需辅助物。



#日志日期:2017-2-25 星期六(Saturday) 晴 复制链接 举报



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