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群星璀璨:CRISPR 技术的研发之路(二)
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作者:haihao8 提交日期:2017-2-22 21:48:00 | 分类:未分类 | 访问量:483

证实CRISPR的功能以及发现其相应组件

   Bolotin 提出的关于反义RNA抑制噬菌体的基因表达的猜想,是新世纪之初真核生物的研究中的热门。这项研究几乎与茂季卡的发现同步,在上世纪九十年代初,Jorgensen研究组在植物研究中发现这样一个现象:外源转入基因会产生抑制内源基因表达。1992年,Romano和Macino,以及1995年,Guo和Kemphues,也分别在真菌和线虫研究中也发现了类似现象。

   到1998年,Fire和Mello在线虫进行反义RNA抑制的研究中,发现相对于单链(无论是正、反义)RNA的输入,双链RNA的输入对标靶基因具有更强的抑制效果。正因为这个实验,Fire和Mello共同获得了2006年的诺贝尔医学及生理学奖。

   这叫做RNA干扰----RNAi。其RNA则称为siRNA。

   而与之平行的研究进展还有“小RNA”的发现---microRNA----miRNA。

   后来的研究表明,siRNA和miRNA的功能大同小异,都是通过自身RNA的序列与靶标基因转录的mRNA的序列互补,而与mRNA结合,引导与其结合的核酸酶对mRNA进行切割,从而造成mRNA不被进一步翻译成蛋白质的结果-----基因沉默。也就是说,这些小片段的RNA与核酸酶的结合,可以比喻为定向导弹,由小片段RNA指引核酸酶去切割特定的mRNA。

   RNA干扰的作用,主要是进行基因调控,对基因的表达能够起到降低、减缓、以至于完全抑制的水平。这些RNA都是从生物基因组的DNA序列转录而来,没有基因功能,不能继续被转译成蛋白质------在过去曾被认为是垃圾DNA。其中有一些被发现属于病毒或寄生虫基因的片段。因此就有一种猜想,认为它们也是对外来入侵的一种防范作用:通过保留这些曾经是入侵之敌的基因片段,在再次遭遇相同敌人时,即可运用RNA干扰的方式,抑制对手的基因表达。

   说到这里,或者就能理解Bolotin当时提出的在细菌基因组中的具有回文结构的CRISPR,是细菌用来以反义RNA的方式来抑制入侵的噬菌体的猜想的理论来源了。 而且应该说明的是,无论是siRNA还是miRNA都有一定的发卡结构,也即:转录它们的DNA在序列上存在回文序列,导致单链的RNA可以弯曲回头与自身的序列互补----形成发卡结构。

   Bolotin的猜想很有道理,但还是错了。那么实验是如何证实了茂季卡的CRISPR是细菌获得性免疫的猜想,又是如何推翻了Bolotin在当时RNAi大热的环境下的那个靠谱的进一步的分子生物学水平的猜想呢?

   2000年,博士毕业于法国斯特拉斯堡大学的Philippe Horvath,因着对制作酸菜的乳酸菌的兴趣而加入了食品公司Rhodia。公司给他的任务是:研发乳酸菌的鉴定方法,从DNA水平上区别能够抵御噬菌体感染的Streptococcus thermophiles(嗜热链球菌,一种乳酸菌)的不同菌株。2002年,在荷兰举办的一次乳酸菌研讨会上,Horvath听说了CRISPR,随之把这个发现应用到了他自己的研究中。2004年底,他发现了spacers和对噬菌体抵抗力之间的关系,但看到茂季卡和Vergnaud几个月后的论文,Horvath放弃了把这个发现单独发论文的想法,而继续深入研究,希望能用实验来证实他的发现。

   2005年,Horvath和其同事Rodolphe Barrangou, Sylvain Moineau一起,使用一株对噬菌体感染没有抵抗力的Streptococcus thermophiles和两种噬菌体为原材料,进行了细菌抗噬菌体的遗传筛选实验。不同于传统的突变筛选方式(比如细菌表面的噬菌体受体的改变),他们聚焦于细菌基因组的CRISPR序列的改变。实验证明:细菌CRISPR序列中插入的与噬菌体基因片段序列相同的spacers越多,其对噬菌体的抵抗力越强。这篇论文2007年4月13号发表在《科学》期刊。

   不仅如此,他们还对两个基因进行了研究:cas7 和cas9 (cas---CRISPR associated)。这两个基因都和CRISPR的功能有关。但是,一旦CRISPR的序列中插入了某个噬菌体的基因片段的spacer后,cas7就不再有存在的必要(去掉它细菌仍然保有对这个噬菌体的抵抗力),说明cas7基因所表达的蛋白质的功能,应该是在于在CRISPR序列中插入新的spacers。

   而cas9则不同,失去这个基因,则无论CRISPR中是否已经插入了特定噬菌体的基因片段,细菌都对这个噬菌体没有了抵抗力。所以,他们的推测是:cas9具有核酸酶的功能,是spacer引导cas9基因的产物对噬菌体的核酸进行了切割,导致噬菌体无法在细菌体内扩增 ----这和Bolotin的猜想很相似(还有Makarova,这里不提),不同的是:他们发现了cas9。现在最常用的CRISPR方法,实际叫做CRISPR-cas9,用的就是这个酶。

   最后,他们还发现有的噬菌体可以反制细菌因CRISPR序列而产生的抵抗力:和CRISPR 序列中spacer的序列相对应的噬菌体基因片段产生突变,仅仅是一个核苷酸的变化,就导致了CRISPR失灵----这个获得性免疫需要精准无误的DNA序列吻合!

   科学发现就是这样一步步地慢慢走,到此,茂季卡的猜想得到证实,Bolotin的进一步猜想还没被推翻,但有了新的发现。

John van der Oost, 1989年博士毕业与阿姆斯特丹的自由大学,他原本的研究方向是蓝绿藻光合作用的代谢途径,以期找到人类新的替代能源。2005年,他出于对美国国家黄石公园著名的Sulfolobus solfataricus,一类极端嗜热古菌(泉古菌),进化途径的好奇,和美国微生物及计算生物学家Eugene Koonin建立了合作关系。Koonin已经对CRISPR系统展开了研究,在去和van der Oost会面之时,向他介绍了CRISPR系统当时遭遇的困境。

   CRISPR系统立刻引起了van der Oost的极大兴趣,他正好刚刚从荷兰国家科学基金申请到了一笔研究蓝绿藻的资助,于是便决定分出一部分经费用于CRISPR系统的研究。

   他们做了这样几个实验:
1, 把大肠杆菌的CRISPR 系统加入到一株原本不具备CRISPR系统的大肠杆菌中,然后研究CRISPR蛋白(cas)的作用。他们发现:CRISPR最早被转录为一条较长的RNA链,然后和cas蛋白结合,随即被剪切为大约为61个核苷酸的短链,称为crRNA。他们于是提纯了一组结合了crRNA 的cas蛋白,然后把结合的crRNA经过克隆然后测序,发现:所有crRNA都起始于一段最少8个核苷酸的重复回文序列,然后是完整的spacer,和随后的另一段重复回文序列。这说明重复回文序列起着形成crRNA 二级结构的功能(Sorek et al 在2008年 《国家微生物综述》论文中的猜测)。

2, 第一次人工合成了含有四个Lambda 噬菌体基本基因的crRNA序列于CRISPR排序中。正如他们所预测的那样:基因组中含有了他们人工制作的CRISPR排序的大肠杆菌,都从原本的Lambda 噬菌体敏感而转为对其产生了抵抗力。证明了crRNA序列是CRISPR让细菌产生获得性免疫的基础。

3, 他们制作了两种不同的CRISPR排序:一种其序列与噬菌体的密码DNA及mRNA互补,另一种和相应的非密码DNA 互补(双链DNA,一链为密码DNA,可转录 mRNA;另一链为互补DNA,非密码,不可转录---若反向含其他基因另说)。实验证明,后一种,与非密码DNA互补的CRISPR, 让细菌产生更强的抗噬菌体的能力。由此间接推翻了Bolotin建立在RNAi理论上的反义RNA的猜测。实验暗示:CRISPR系统攻击的是噬菌体的DNA,不是mRNA。

   这篇论文发表在2008年8月15号的《科学》期刊上。鉴于《科学》编辑的小心翼翼的提醒,Oost只是把“CRISPR系统攻击的是DNA”写成是“猜想”。



#日志日期:2017-2-22 星期三(Wednesday) 晴 复制链接 举报



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