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群星璀璨:CRISPR DNA裁剪技术的研发之路
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作者:haihao8 提交日期:2017-2-21 21:03:00 | 分类:未分类 | 访问量:1261

CRISPR 是目前分子生物学研究中应用最广泛的基因组剪裁技术(Genome Editing)。所谓“基因组裁剪”,并非是指改变了一组基因。这是个翻译问题,“基因组”特指Genome,说的是生物体本身的基因,区别于通过人工或者自然感染而进入生物细胞内的“外来基因”。

 CRISPR的应用不仅仅限于研究,用打断、改变、甚至置换生物体某个基因的方法,研究生物性状的改变,从而发现该基因的功能;它还可以被应用于医学:基因治疗---破坏“坏”基因以至于置换“好”基因,来改善病人的健康水平;同样,也可以被用于农作物基因的改变。

 目前主要有四种基因裁剪技术:Meganuclease, ZFNs, TALEN, 和CRISPR-Cas。其中应用最广泛的是CRISPR,因为它容易操作且更为精确,少说也有上千个分子生物学实验室每天都在使用。

 和所有现代生物研究技术的发明一样,CRISPR从理论发现到技术成熟,也自有它独特的传奇色彩。各位若不嫌唠叨,且听我从头细说。

  

鼻祖:佛朗西斯科•茂季卡发现CRISPR并推论其功能

 上世纪的八十年代末,中国轰动了世界,无数青年学子走出大学校门,投身到争取自由民主的滚滚洪流之中。而在远隔千山万水的地中海之滨,西班牙的圣波拉海滩边,有位土生土长的年轻人,佛朗西斯科•茂季卡,却安详自在地开始了他在阿里坎特大学的博士生研究之路。

 圣波拉是著名的海盐产地,茂季卡所要研究的生物是一种生活在高盐浓度中的古菌:Haloferax mediterranei。古菌虽是原核生物,形似细菌,但其某些代谢途径又与真核生物更接近,且又有自己的特性,所以在生物学分类上特意划出比门更高一级的“域”来区别三大类:细菌域、古菌域、和真核域。Haloferax mediterranei 由于生长速度快、代谢效率高、以及遗传物质相对稳定的特点,而成为学界研究古菌的模型.

 茂季卡的导师在早前的研究中发现:培养基含盐浓度的变化,能够影响限制性内切酶对此菌基因组的切割。换句话说,生活环境中盐的浓度的变化,导致了此菌基因序列的变化(从而影响了针对特殊DNA序列进行切割的内切酶的功能的发挥)。茂季卡的博士研究,因此而设定为找出这个现象的原因。

 茂季卡对此菌的部分基因组进行了序列测定,结果他发现了一个奇怪的现象:以30个核苷酸为一组的DNA,组内呈现回文序列,而且不断重复,其间被大约36个核苷酸(spacer)所分开,形成30-36-30-36-30….的独特DNA序列形式。古菌基因组的这种序列重复在当时没有任何报告,于是他把这个发现发表在了1993年的《分子微生物学》期刊上。
 继续深入研究下去,他又在其他高盐古菌的基因组中发现了类似的重复序列;搜索研究论文,他找到1987年日本学者曾在大肠杆菌的基因组中发现了相似的重复序列,虽然具体的DNA序列不同,但重复的方式很像。由此茂季卡推理:这种出现在不同生物物种中的特殊形式的DNA重复序列,应该对某种重要的生物功能发挥了信号作用。他把这些发现和推理写成论文,发表在1995年的《分子微生物学》期刊上,然后就去了牛津大学做博士后研究。

 茂季卡从牛津完成博士后研究后,回到阿里坎特大学担任教职并继续自己的研究。他把这种奇怪的重复序列命名为SRSRs (short regularly spaced repeats),后来在他的建议下,最终命名为 CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)。到2000年, 茂季卡已经在20种不同的微生物中发现了CRISPR,由此引起了生物界的重视。随后两年,其他研究者们把这个数字翻了一倍。

 然而一个重要的问题是:CRISPR到底有什么功能?基因调控?DNA复制区域划分?DNA 修复?等等各种猜想不一而足,但都被后来的实验逐一推翻。

 距今十四年的那个八月,也很炎热。茂季卡躲在办公室的空调凉爽中,又一次琢磨这个奇怪序列的意义。他把目光从那些由30个核苷酸组成的回文序列移开,专注到了隔开这些回文序列的那些由36个左右核苷酸组成的spaces。他把这些spaces 的DNA序列输入BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)系统,试图寻找任何其他生物基因组中的相似序列。类似的搜索他曾经做过,并无所获。但由于BLAST系统更新很快,不断有新的DNA序列添加进来,因此茂季卡过段时间就会再搜索一次,试试运气。这次,他掘到了金矿!

 在他新近发现的大肠杆菌菌株的CRISPR序列里,有个spacer的DNA序列和感染大肠杆菌的P1噬菌体的基因序列吻合!有意思的是:他用来测序找到这个CRISPR序列的那株大肠杆菌,是抗P1噬菌体感染的菌株。

 噬菌体,可以看作是细菌的病毒,它通过把自身内容物(DNA和蛋白质)注入细菌细胞内,尔后占据细菌的DNA复制和蛋白质制造系统,而大量复制自己。

 到了周末,茂季卡兴奋又疲倦地前后向BLAST系统输入了大约4500个spacers,找到了将近50个序列吻合于各种不同病毒或质粒(类似于噬菌体)的基因序列。他因此得出了一个清晰的结论:CRISPR 的信号作用,应该是其DNA编码了某种获得性免疫指令,从而使得微生物免于被特定的噬菌体(病毒、质粒)所感染。

 茂季卡以此发现为基础而写出的论文,却在期刊发表上经历了长达十八个月的艰难历程。茂季卡把论文投给《自然》,到2003年11月,《自然》编辑连同行评议都省却而直接退稿,理由竟然是“了无新意(the key idea was already known)”。2004年1月,《美国国家科学院报》也以“因缺乏足够新意和创见,而不值送出做同行评议”为由退稿。随后,《分子微生物学》和《核酸研究》也相继退稿。最后茂季卡不得不把论文投给《分子进化》,经历了将近一年的来回评议及修改,2005年2月1号终于在该期刊得以发表。

 几乎与此同时,法国学者 Gilles Vergnard也有类似发现。Vergnard的研究方向原本是人类遗传基因,在举世闻名的巴斯德研究所获得博士学位及进行了博士后研究后,他进入政府部门,设立实验室,在人类遗传基因领域耕耘了十年。上世纪九十年代第一次海湾战争后,情报部门关于萨达姆侯赛因致力于研发生物武器的报告,导致法国国防部要求Vergnard的实验室转行,把精力专注于法医微生物:通过微生物遗传物质亚株间的相互不同,找到可行的方法来鉴定微量致病菌。

 考虑到人类的法医鉴定主要使用“回旋重复”序列的不同来作为DNA指纹,Vergnard寄希望于能在炭疽菌和鼠疫菌的基因组中找到类似的重复序列用于鉴定方法。他鉴定了法国国防部提供的1964-1966年越南鼠疫流行时的61个鼠疫杆菌样本,发现它们的回旋重复序列完全一致;而他的同事Christine Pourcel发现了一个例外:CRISPR的序列不同(除CRISPR外,细菌还存在其他不同的DNA重复序列)。这些不同处都发生在CRISPR序列的“前端”(5’端),新加入的spacers 大多和噬菌体的基因序列吻合。
 由此,Vergnard得出了一个结论:CRISPR应该是一种防御机制,它们“记住了曾经的基因侵犯”。Vergnard的这篇论文遭遇了和茂季卡同样的命运:先后被《美国国家科学院报》、《细菌学报》、《核酸研究》、以及《基因组研究》退稿,最后在2005年3月1日发表在《微生物学报》上。

 当然,还有一位值得一提:Alexander Bolotin,一位在法国国家农科院任职的俄裔微生物学家。他的论文专注在CRISPR的来源,由于之前被其他期刊退稿,直到2005年3月(茂季卡论文发表后的一个月)才被《微生物学报》所接受,在2005年9月得以发表。他是第一个探讨了CRISPR免疫机制的分子生物学原理:CRISPR转录的反义RNA抑制了噬菌体基因的表达-----虽然后来被证明是错误的。



#日志日期:2017-2-21 星期二(Tuesday) 晴 复制链接 举报



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